Phân tích thuốc trừ sâu Carbamat, Aflatoxin, Glyphosate, Amino axít, Lipid, … với HPLC với kỹ thuật dẫn xuất phản ứng sau cột
Như chúng ta biết đến kỹ thuật phân tích các hợp chất hóa học không bền nhiệt độ cao trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) là kỹ thuật được lựa chọn để tách phân tích dựa trên sự phát hiện, nhận dạng của chúng, định lượng và / hoặc tinh chế. Hầu hết hữu cơ chất, và chắc chắn là phần lớn không bay hơi hoặc nhiệt các phân tử không bền có thể thích nghi với kỹ thuật phân tách HPLC. Hơn nữa, sự sẵn có của một lượng lớn nhiều loại cột LC, kích thước hạt và sự phân cấp gần như vô hạn của các loại pha động và phân cực trao quyền cho sự phân biệt đối xử khả năng và khả năng thích ứng dễ dàng của HPLC. Với các đầu dò thông thường như UV, DAD (PDA), huỳnh quang FLD, RID, điện hóa hay khúc xạ kế RI,…
Đối với một số ứng dụng để tách được các hợp chất ra khỏi cột và phát hiện bằng các đầu dò thông dụng trên, các chất đó cần phải được phản ứng dẫn xuất tạo phứng ứng sau cột và phát hiện bằng đầu dò UV, FLD một cách dễ dàng.
Kỹ thuật dẫn xuất phản ứng sau cột
Một kỹ thuật được thêm vào sau cột phân tách HPLC trước khi chất phân tách đi vào đầu dò huỳnh quang hoặc UV đã được chứng minh là rất phù hợp cho tăng cường khả năng phân biệt và phát hiện chất phân tích LC là quá trình tạo dẫn xuất sau cột (hay còn gọi là PCD). Đưa ra tín hiệu phổ biến khắp nơi, dễ sử dụng và tương đối chi phí thấp của phần cứng phát hiện; UV và có thể nhìn thấy sự hấp thụ ánh sáng cùng với sự phát xạ huỳnh quang thường là các phương pháp phát hiện được lựa chọn cho phân tích HPLC khối lượng lớn và / hoặc thường quy. Nó là những tín hiệu này, phần lớn, rằng các phương pháp PCD được sử dụng để tăng cường. Trong khi hầu hết các chất cho thấy một số hấp thụ trong vùng UV / VIS của của phổ điện từ, phản ứng thường yếu và dễ bị nhầm lẫn bởi các chất tạo màng. PCD khắc phục nhược điểm này bằng cách sử dụng các phương pháp tổng hợp để chuyển đổi các chất phân tích được phân vùng sắc ký thành dẫn xuất với tế bào sắc tố tạo ra cường độ các đỉnh hấp thụ hoặc huỳnh quang, thường chuyển sang vùng bước sóng dài hơn của quang phổ để giảm khả năng gây nhiễu.
Theo đó, việc phát triển hệ thống PCD được hướng dẫn bởi một bộ tiêu chí được thiết kế để tối ưu hóa khả năng phản ứng của chất phân tích và nâng cao cường độ tín hiệu mà không ảnh hưởng hiệu quả sắc ký hoặc độ tái lập. Để tối đa hóa độ nhạy và độ chọn lọc tín hiệu cho cả mục đích phát hiện và định lượng PCD thuốc thử phải đóng góp ít nhất có thể vào nền dựa vào đó tín hiệu được đo. Quy tắc này phải được áp dụng với mức độ nghiêm ngặt ngày càng tăng khi nồng độ chất phân tích đạt đến giới hạn của phương pháp phát hiện trong đó độ nhiễu xung quanh ngày càng tăng che khuất một tín hiệu ngày càng yếu. Tiêu chí quan trọng khác là phát triển PCD yêu cầu rằng các phản ứng và các sản phẩm vẫn còn trong dung dịch.
Sự hình thành của một chất kết tủa, với khả năng ngăn chặn ống mao dẫn, nổ lò phản ứng nổ / hoặc tắc nghẽn của đầu dò lưu lượng, cùng với sự hình thành của các hiện tượng gây nhiễu quang học khác như nhũ tương hoặc sự phân tán, làm giảm độ nhạy của đầu dòbằng cách chặn hoặc phân tán tín hiệu. Có thể so sánh được vấn đề phát sinh khi các chất lỏng trộn lẫn không hoàn toàn, khác nhau về thành phần hoặc nhiệt độ, tạo ra tính không đồng nhất cục bộ thay đổi trong khúc xạ.
Hầu hết các đầu dò hiện đại được thiết kế để bù đắp cho những xáo trộn này, nhưng nó là tốt hơn nhiều để tránh vấn đề bằng cách đảm bảo rằng thành phần dung dịch và nhiệt độ luôn đồng nhất trong suốt quá trình dẫn xuất trước khi chất lỏng đó đến đầu dò. Các biện pháp khác có thể giúp giảm méo tín hiệu bao gồm việc sử dụng các máy bơm duy trì một tốc độ dòng chảy với độ chính xác cao. Làm nóng dung dịch trong một lò phản ứng PCD, hoặc ngược lại làm mát sau phản ứng, có thể dẫn đến sự phát triển của bong bóng khí. Cái này thường có thể được ngăn chặn bằng cách áp dụng áp suất ngược trở lại vừa đủ trên lưu lượng của đầu dò. Các lưu ý cần biết để tích hợp bộ phản ứng sau cột PCD vào hệ HPLC là hệ thống phản ứng PCD cần phải tương thích với pha động HPLC và không phải chỉ là bổ sung thuốc thửvà phản ứng với các dòng chảy bất thường có thể gây ra dải lan rộng hoặc ảnh hưởng đến khả năng tạo các thời gian lưu giữ của hệ thống HPLC. Các quy tắc thông thường cần nhớ là giảm thiểu độ dài của đường dẫn dòng chảy giữa lối ra cột và máy dò và giảm thời gian tạo dẫn xuất, nếu cần, thường là bằng cách tăng nhiệt độ. Duy trì dòng chảy chính xác kiểm soát cũng quan trọng trong việc bổ sung thuốc thử PCD vì nó đối với tách sắc ký. Máy bơm của hệ PCD phải chắc chắn và sử dụng các thành phần có bề mặt bên trong trơ sẽ tiếp xúc với thuốc thử mạnh về mặt hóa học.
Hệ phản ứng sau cột sẽ được thiết lập phù hợp theo ứng dụng của khách hàng, có thể dùng 1 bơm thuốc thử phản ứng hoặc 2 bơm thuốc thử phản ứng với gia nhiệt như hình ảnh bên dưới:
Bảng bên dưới mô tả một số ứng dụng để tham khảo và thiết lập cấu hình cho bộ phản ứng sau cột phù hợp:
|
Ứng dụng |
Kênh thuốc thử A |
Buồng phản ứng gia nhiệt |
Nhiệt độ thiết lập (0C) |
Kênh thuốc thử B |
Buồng phản ứng nhiệt độ môi trường |
Loại đầu dò sử dụng |
|
Carbamates |
NaOH |
500uL |
100 |
OPA |
150uL |
Huỳnh quang |
|
Glyphosates |
NaOCl |
500uL |
40 |
OPA |
150uL |
Huỳnh quang |
|
Aflatoxins |
Iodine |
1.44 ml |
40 |
|
|
Huỳnh quang |
|
Carbohydrates |
NaOH |
500uL |
40 |
|
|
DAD |
|
Lipids |
Phenacyl |
700 ul |
100 |
|
|
UV-vis |
|
Amino Acids by Ninhydrin |
Ninhydrin |
500uL |
120-140 |
|
|
UV-vis |
|
Amino Acids by OPA |
NaOCl |
500uL |
40 |
OPA |
150uL |
Huỳnh quang |
|
Amino Acids, Primary only |
OPA |
150uL |
30 |
|
|
Huỳnh quang |
|
Chondroitin sulfate |
2-Cyanoacetamide/ NaOH |
1.44 ml |
120 |
|
500uL |
Huỳnh quang |
Ví dụ về phân tích các hợp chất Carbamate sử dụng phản ứng sau cột PCD
Máy sắc ký lỏng HPLC
Hãng sản xuất: Knauer
Xuất xứ: Đức
Hệ thống gồm:
- Bơm dung môi 4 kênh P 6.1L
- Buồng điều nhiệt cột CT 2.1L
- Bộ tiêm mẫu tự động AS 6.1L
- Đầu dò huỳnh quang FLD
- Bộ phản ứng sau cột 2 bơm thuốc thử
- Cột phân tích: Eurospher 100-5 C18, 250 x 4.6 mm ID
- Dung dịch chuẩn và các hóa chất OPA và 2-mercaptoethanol
Điều kiện chạy máy như sau:
– Pha động:
Kênh A H2O;
Kênh B : Methanol
– Chạy Gradient:
0 – 0.5 min 82% A
0.5 – 29 min 82% – 30% A
29 – 31 min 100% B, column rinsing
31 – 36 min 82% A, re-equalibration
– Tốc độ dòng: 1.0 ml/min
– Đặt nhiệt độ cột: 42 °C
– Thể tích: 10 μl
– Bộ phản ứng PCD với 2 bước
1st phản ứng (500 μl): đặt nhiệt độ 100 °C dẫn xuất với NaOH
2nd phản ứng (150 μl): nhiệt độ môi trường với OPA và 2-mercaptoethanol derivative
– Đầu dò huỳnh quang: đặt sóng kích thích 330 nm, bước sóng phát xạ tại 465 nm
Các hợp chất phát hiện bao gồm: Substances: Aldicarb, Aldicarb sulphoxide, Aldicarb sulphone, BDMC, Carbaryl, Carbofuran, 3-Hydroxycarbofuran, Methiocarb, Methomyl, 1-Naphtol, Oxamyl, Propoxur
Kết quả phân tích:
Tham khảo tư vấn kỹ thuật và ứng dụng: 0969848685
